La funzione dei toll-like receptor

Giorgio Bartolozzi

Membro della Commissione Nazionale Vaccini

Indirizzo per corrispondenza: bartolozzi@unifi.it

Esistono due sistemi, che contribuiscono all'immunit� negli umani:

• il sistema innato (non specifico, non adattativo)

• il sistema adattativo (acquisito, specifico)

Ambedue sono essenziali per la sopravvivenza degli individui.

Il primo � costituito da un gran numero di cellule specializzate come i macrofagi, i neutrofili, le cellule natural killer (NK), le cellule dendritiche (DC), insieme a molte sostanze, come le citochine, gli interferoni α, β e γ (INF), le chemochine, la proteina C reattiva e le proteine che accompagnano la cascata del complemento. I componenti del sistema innato possono essere attivati entro pochi minuti od ore dall'inizio dell'infezione o dalla somministrazione del vaccino. Questa risposta rapida � indispensabile per la sopravvivenza degli individui, perch� in generale ci vogliono molti giorni affinch� i componenti del sistema adattativo entrino in funzione.

Una volta si pensava che il sistema innato e il sistema adattativo fossero nettamente distinti, ma ora si pensa che essi siano intimamente connessi e che il secondo non possa manifestarsi senza essere attivato dal primo.

Mentre l'induzione delle risposte adattative immuni specifiche richiede un numero di giorni relativamente alto (7-10 giorni), l'immunit� innata fornisce difese entro pochi minuti od ore dall'inizio dell'infezione. L'immunit� innata non fornisce una risposta specifica: essa si basa sulla digestione dei microrganismi e degli antigeni estranei da parte dei macrofagi. Un sofisticato sistema di recettori, i recettori toll-like fornisce considerevole attivit� nei confronti dei patogeni (un'ampia variet� di batteri, funghi, protozoi e virus) e delle sostanze estranee.

I toll-like recettori sono importanti per la clearance dei patogeni. A oggi una decina di differenti molecole toll-like � stata clonata, dimostrando una specificit� generica per ampie categorie di patogeni, che si differenziano per relativamente piccole caratteristiche molecolari. Per esempio il toll-like 4 � responsabile del riconoscimento dell'endotossina batterica e di altre sostanze.

I toll-like recettori sono espressi sulle cellule mielomonocitiche, sulle cellule endoteliali ed epiteliali, come anche sulle cellule di vari organi. I recettori toll-like sono proteine transmembrana che hanno un comune dominio extracellulare, ricco di leucina e un dominio citoplasmatico comune. La protezione immediata, fornita da questi recettori, si basa sull'attivit� di molecole di ossigeno reattivo e di azoto-intermedio, peptidi antimicrobici, citochine, chemochine, molecole di adesione e proteine della fase acuta.

Tabella. XXX-Ruolo dei recettori toll-like (TLR) nel riconoscimento dei patogeni e nelle fisiopatologia delle malattie dell'uomo

(Abreu MT e Arditi M, 2004).

Recettore toll-like

TLR10

Sconosciuta

Sconosciuto

Con la scoperta e la caratterizzazione dei recettori toll-like � divenuto evidente che la risposta immune innata � essenziale per innescare le risposte immuni adattative.

Il sistema immune innato pu� giocare un ruolo in molte malattie umane: sebbene la principale funzione dei recettori toll-like sia quella di riconoscere i patogeni, essi possono essere interessati alla patogenesi della malattia, soprattutto quando la risposta innata sia inappropriata ed eccessiva; qualcosa del genere pu� contribuire alla genesi di alcune comuni malattie, come la sepsi grave, la meningite, l'aterosclerosi, la malattia cronica intestinale, le malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla, il lupus eritematoso sistemico e l'epatite.

E' ormai evidente che i recettori toll-like hanno, come ruolo primario, quello di riconoscere patogeni batterici, virali o fungini, che potrebbero essere deleteri per l'organismo ospite. Ne deriva che mutazioni a carico dei recettori toll-like contribuiscono ad aumentare la suscettibilit� per alcune infezioni o per rendere pi� grave il decorso della malattia. E' stato dimostrato che mutazioni rare dei recettori toll-like 4, contribuiscono a sviluppare infezioni meningococciche gravi. Analogamente � stato visto che la deficienza del recettore associato all'interleuchina 1 chinasi-4 (IRAK-4) � stata diagnosticata in 28 pazienti con malattia invasiva, causata da batteri piogeni, principalmente lo Streptococcus pneumoniae e, in minor misura, lo Staphylococcus aureus.

Analogamente la deficienza di UNV-93B sembra conferire una predisposizione selettiva verso la meningo-encefalite, causata dal virus dell'herpes simplex.

Figura 1. I recettori toll-like e i loro ligandi (Harrison's , Principles of Internal Medicine 2005, 16� ed. Pag. 1913)

Alcune molecole, associate ai patogeni, e alcuni prodotti, originati dall'ospite, utilizzano i membri della famiglia dei recettori toll-like (TLR) come trasmettitori di segnali di grande importanza. Il TLR2 riconosce una variet� di prodotti microbici; il TLR4 � essenziale per segnalare la presenza di lipopolisaccaridi (lPS), originati dai batteri gram negativi; fanno eccezione la Leptospira e la Pseudomonas gengivalis, i cui polisaccaridi sono riconosciuti dal TLR2. Il TLR4 riconosce non solo le sostanze dei virus e delle piante, ma anche i prodotti originati dall'organismo stesso del soggetto, come la proteina dello shock termico 60 (HSP60) e frammenti delle fibronectina e dell'ialuronan. In confronto ai TLR2 e TLR4, il riconoscimento da parte dei TLR5 e TLR9 sono pi� ristretti e richiedono rispettivamente le segnalazioni della flagellina e del CpG mediato dal DNA.

I 10 recettori toll-like (TLR) (ma soprattutto i TLR3 e TLR4) utilizzano l'IRAK-4 come trasmettitore per l'interferon antivirale. L'IRAK-4 d'altra parte � essenziale per l'induzione precoce delle citochine pro-infiammatorie, come il tumor necrosis factor α, l'interleuchina-1β e l'interleuchina-6 da parte dei batteri piogenici, attraverso il TLR1/2, TLR4, TLR5, TRL2/6 e TLR9 (vedi Figura 2). Le citochine, la cui produzione � indotta dai TLR, determinano l'infiammazione e tutti i fenomeni a essa connessi.

I segnali del vari TLR reclutano i linfociti T eB del sistema dell'immunit� adattativa perch� inizino la loro risposta immune umorale e cellulare.

Quattro TLR (TLR3, TLR7, TLR9, TLR10) richiedono l'UNC-93B per la segnalazione.

I TLR sono localizzati anche a livello dell'endotelio ipotalamico: essi vengono attivati da prodotti microbici (endotossine soprattutto), originate da germi gram negativi, e dagli acidi teicoici dei batteri gram positivi, a produrre PGE2 e quindi la febbre.

Figura 2. Vie di segnalazione dei recettori toll-like per la produzione delle citochine pro-infiammatorie in risposta ai prodotti batterici

(Harrison's , Principles of Internal Medicine, 2005, 16� ed., pag. 704)

Alcune sostanze presenti sulla superficie delle cellule microbiche interagiscono con il CD14, che a sua volta interagisce con i recettori toll-like (TLR); alcuni costituenti microbici non necessitano del CD14 per interagire con i TLR: sia il CD14 che i TLR contengono domini ricchi di leucina. Associato al TRF4 c'� un cofattore (MD-2) che facilita la risposta ai lipopolisaccaridi. La parte citoplasmatica dei TLR si lega con la proteina, adattarore generale, MyD88, che si lega anche ai membri delle proteine transmembrana, recettori dell'interleuchina-1. La proteina adattatore, contenente il dominio TIR (TIRAP), partecipa al trasferimento dei segnali originati dal TLR4. Si arriva cos� all'attivazione delle molecole di trasferimento del segnale, come 'IRAK1/2 (recettore dell'interleuchina 1 chinasi 1- o 2), il TRAF-6 (recettore del tumor necrosis factor associato al fattore 6), TAK-1 (fattore β trasformante la crescita, attivante la chinasi 1), TAB1 (proteina 1 legante TAK1). Oltre all'attivazione di altre vie di segnalazione, che portano alla produzione di citochine e di risposte allo stress, come la via del c-Jun N-terminal chinasi (JNK) e la via MAP chinasi chinasi (MEKK1), i segnali mediati dal TLR portano all'attivazione del complesso della chinasi inducibile, IKK-α, -β e �γ. L'IKK-γ � chiamato anche NEMO (fattore nucleare kB (NF-kB) modulatore essenziale) fa parte di un vasto complesso che fosforilizza la porzione inibitoria (I) dell'NF-kB, che porta alla liberazione dell'IkB da parte dell'NF-kB. L'IkB fosforilato (PP) viene degradato e l'NF-kB traslocato al nucleo, dove si lega ai siti di trascrizione sui geni bersaglio, la maggior parte dei quali codifica per le proteine proinfiammatorie.

La mancanza del TRF4 � incompatibile con la vita, perch� si associa a malattie piogeniche invasive, causate tipicamente da batteri gram positivi, come lo Streptococcus pneumoniae e lo Staphylococcus aureus e pi� di rado da batteri gram negativi. Le infezioni iniziano nell'infanzia e nelle fanciullezza e sono rappresentate dalla meningite, artrite e/o setticemia. Altri aspetti tipici includono le lievi reazioni cliniche e le infiammazioni biologiche oltre alla ritardata caduta del cordone ombelicale. Con queste malattie sono gi� state descritte 18 famiglie con 28 pazienti in 11 Paesi. E' stato notato che i soggetti con deficienza di IRAK-4 non sono particolarmente suscettibili alle infezioni da micobatteri, da funghi e da virus. Al contrario la mancanza di UNC-93B si associa a encefalite da herpes virus e non a infezioni dovute a batteri.

Va sottolineato che in questi pazienti non si riscontra nessuna alterazione immunologica sia a carico della serie mieloide che linfoide.

La mancanza di IRAK-4 viene usualmente dimostrata misurando in vitro la produzione di TNF-α o di IL-6 da parte di cellule mononucleate, isolate dal sangue intero e stimolate con agonisti dei TLR (come i lipopolisaccaridi), o usando la prova immuno-enzimatica (ELISA) o infine all'interno delle cellule con la citometria di flusso. Analogamente la mancanza di UNCB-93B viene accertata misurando la produzione di interferon antivirale da parte delle cellule ematiche mononucleate, stimolate con TLR agonisti.

Tutte queste prove sono complesse, costose e richiedono molto tempo, per cui solo pochi laboratori sono in grado di eseguirle.

Di recente � stata descritta una prova rapida e di poco prezzo per la dimostrazione dei difetti dei TLR, basata sulla dimostrazione con la citometria di flusso mediante la valutazione del distacco della L-selettina legata alla membrana (CD62L) dei granulociti (von Bernuth H, Ku C-L, Rodriguez-Gallego C, et al. A fast precedure for the detection of defects in toll-like receptor segnalino. Pediatrics 2006, 118:2498-503).

Con questa nuova prova sono stati studiati 38 controlli sani e 7 pazienti nei quali geneticamente era stata dimostrata la presenza di difetti del recettoritoll-like: 5 pazienti con una deficienza della chinasi 4, associata al recettore dell'interleuchina 1 e 2 pazienti con UNC-93B deficienza.

Nei soggetti con mancanza della chinasi 4, associata ai recettori dell'interleuchina 1, � risultato evidente un disturbo della liberazione della L-selectina dai granulociti, in seguito alla attivazione con agonisti dei recettori toll-like �, 2/6, 4, 7 e 8. Tutti i controlli sani risposero invece normalmente a questa stimolazione.

Gli autori concludono che la valutazione della liberazione della L-selectina, legata alla membrana dei granulociti, mediante la citometria di flusso pu� risultare utile per la dimostrazione delle immunodeficienze primarie nella via dei recettori toll-like, come la mancanza della chinasi 4, associata al recettore dell'interleuchina-1 e la mancanza di UNC-93B. Confermano inoltre che questa prova � semplice e rapida; viene consigliata l'esecuzione di questa prova routinariamente in tutto il mondo nei bambini con malattia pneumococcica e nei pazienti con encefalite da herpes virus.

Considerazioni personali

I recettori toll-like sono un costituente essenziale della immunit� innata, che, come si sa, � comparsa, nella storia dell'evoluzione, molto prima dell'immunit� adattativa; essa � presente, per la prima volta, negli organismi multicellulari e rappresenta una pietra miliare nella lotta contro le infezioni. L'immunit� innata � gi� presente in ogni persona alla nascita: essa blocca l'entrata dei microrganismi, elimina quelli che riescono a passare le barriere cutanee e mucose e costituisce un elemento indispensabile per l'attivazione e l'istruzione dell'immunit� adattativa, altamente specifica e basata sulla comparsa di anticorpi (immunit� umorale) e di cellule (immunit� cellulare).

Essa � costituita da cellule (macrofagi, neutrofili, celllule natural killer, cellule epiteliali delle mucose, cellule endoteliali) e da sostanze, come le citochine, le chemochine, gli interferoni, la poroteina C reattiva, la catena del complemento, la lecitina legante il mannosio e altre.

L'immunit� innata � attivata da antigeni non self, da virus, da batteri, da protozoi, da funghi e da organismi pluricellulari; essa inizia precocemente, da pochi minuti a qualche ora dopo il contatto con agenti estranei e si basa sulla neutralizzazione delle sostanze estranee e degli agenti infettivi. La sua caratteristica � quella di rimane uguale nel tempo, cio� di non aumentare d'intensit� anche dopo ripetute stimolazioni. Quando lo stesso agente infettivo colpisce l'individuo per la seconda volta, la risposta � uguale, pari pari a quella che si era manifestata la prima volta. Non c'� in altre parole nessun tipo di adattabilit� in seguito a contatti successivi.

I sensori sono rappresentati dai recettori toll-like, presenti sulla superificie di molte cellule e dalle proteine leganti il mannosio.

I recettori toll-like costituiscono infatti la prima linea di difesa: se ne conoscono per ora 10, ognuno stimolato da antigeni diversi. Si tratta di proteine transmembrana con un dominio extracellulare e un dominio citoplasmatico.

Essi sono i segnalatori della presenza di agenti estranei: dopo la loro stimolazione si manifestano numerosi eventi:

• produzione di ossigeno nascente

• attivazione della cascata del complemento

• attivazione dell'interferone

• attivazione delle cellule natural killer

• produzione di citochine e di chemochine

• produzione di molecole di adesione

• produzione delle proteine della fase acuta

• produzione di peptidi di vario tipo.

Le mutazioni dei recettori toll-like costituiscono un settore nuovo della patologia infettiva, perch� una loro variazione funzionale (polimorfismo) pu� associarsi a un'aumentata suscettibilit� verso particolari agenti infettivi, in modo tale da rendere pi� facile e talvolta straordinariamente pi� grave una determinata infezione.

Poter oggi disporre di una prova relativamente semplice per identificare i difetti funzionali dei recettori toll-like, apre una finestra nuova del campo della patologia infettiva. E' molto probabile che poter disporre di una prova che pu� essere usata facilmente in un gran numero di condizioni, permetter� l'individuazione di nuove affezioni e anche dei fattori di rischio in situazioni patologiche ben conosciute. Una migliore conoscenza della partecipazione dei toll-like recettori all'immunit� conferita dalla vaccinazione apre nuove strade di ricerca.

Dopo l'era dell'immunit� adattativa e dei relativi anticorpi, si apre una nuova strada, quella dell'immunit� innata e dei recettori toll-like.